ABSTRACT
The objective of this study was to investigate the mRNA expression and protein localization of Grb10 gene in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) from different follicle sizes. Firstly, it was investigated the mRNA expression to correlate with maturation rates. COCs from follicles at 1-3, 4-6, 6-8 and >8mm were used to evaluate Grb10 gene expression by qRT-PCR assay and nuclear maturation rates. It was observed that more competent oocytes (from follicles at 6-8 and >8mm; P>0.05), had lower Grb10 mRNA expression levels when compared to the oocytes from follicles at 1-3 and 4-6mm (P>0.05). After it was performed an immunofluorescence analysis in COCs from different follicle sizes (1-3, 4-6, 6-8 and >8mm) to investigate Grb10 protein localization. Samples were incubated with primary antibody: Polyclonal rabbit anti-Grb10 (1:100). Primary antibody was detected using goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (1:500). Positive fluorescence signal was detected in all analyzed samples but less evident in COCs from largest follicles. These results characterized Grb10 gene in bovine COC and provide evidences for its involvement during oocyte molecular maturation.
O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de RNAm e a localização da proteína Grb10 em complexos cumulusoócito (CCO), oriundos de folículos bovinos em diferentes fases de desenvolvimento. Primeiramente, foi investigada a expressão de RNAm e relacionada com as taxas de maturação. CCOs oriundos de folículos com diâmetro de 1-3, 4-6, 6-8 e >8mm foram utilizados para avaliar a expressão de RNAm por PCR em tempo real e para analisar os estádios de maturação nuclear. Foi observado que os oócitos mais competentes para a progressão meiótica (oriundos de folículos com diâmetro de 6-8 e >8mm; P<0.05) tiveram menor expressão de RNAm para Grb10, quando comparados aos CCOs oriundos de folículos com 1-3 e 4-6mm (P<0.05). Posteriormente, foi realizada a técnica de imunofluorescência em CCOs oriundos de folículos de diferentes tamanhos (1-3, 4-6, 6-8 e >8mm) para investigar a localização da proteína Grb10. As amostras foram incubadas com o anticorpo primário: anti-Grb10 policlonal, produzido em coelho (1:100). O anticorpo primário foi detectado utilizando um anticorpo secundário, IgG anti-coelho, produzido em cabra, conjugado com Alexa Fluor 488 (1:500). A fluorescência foi detectada em todas as amostras analisadas, porém, menos evidente nos CCOs oriundos dos folículos maiores. Os resultados apresentados neste estudo caracterizam o gene Grb10 em CCOs de bovinos e fornecem evidências do seu envolvimento na maturação molecular do oócito.
ABSTRACT
The aim was to develop a timed artificial insemination (TAI) system in suckled beef cows. Cows (n=227), 60-80 days postpartum, received estradiol benzoate (5mg) and a vaginal device containing 250µg of medroxyprogesterone acetate (MPA; day 0). On day six, cloprostenol (125µg) and eCG (400IU) were administrated and calves were weaned for 88h. The devices were removed on day seven (BioRep group) or on day eight (TAI group). All cows of TAI group and cows of BioRep group that did not exhibit standing estrus received GnRH (100µg) on day 9. In experiment I, the follicular growth was monitored daily by transrectal ultrasound exams, from day 6 to day 9. The average size of the dominant follicle on day nine was 11.1±0.99mm (BioRep, n=7) and 11.5±0.65mm (TAI, n=7) and all animals ovulated. In experiment II, the BioRep group cows (n=106) were observed for estrous behavior after withdrawal of the device, twice a day for 48h, and inseminated 12h after detection. In the TAI group (n=107), the devices were withdrawn on day eight and after 24h these cows and those from the BioRep group, which were not stand in estrus, received 100µg of GnRH and TAI 16h later. The pregnancy rates were 57.6 percent (BioRep) and 52.3 percent (TAI). In conclusion, an increase on MPA exposure time did not affect the follicular dynamics and pregnancy rates and allow TAI without estrous observation. Furthermore, the treatment for eight days provides an efficient TAI system in suckled beef cows.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo de inseminação artificial com tempo fixo (IATF) em vacas de corte durante período de amamentação, avaliando o intervalo entre a retirada do progestágeno e a aplicação de GnRH sobre a dinâmica folicular e a prenhez. Para tanto, vacas (n=227) em pós-parto de 60 a 80 dias receberam benzoato de estradiol (5mg) e um pessário vaginal de acetato de medroxiprogesterona (250mg MAP; dia 0). No dia seis, os animais receberam cloprostenol sódico (125µg), gonadotrofina coriônica eqüina (400UI) e desmame temporário (88h). O MAP foi retirado no dia sete (Grupo BioRep) ou no dia oito (Grupo IATF). Todas as vacas do grupo TAI e aquelas que não manifestaram cio do grupo BioRep receberam GnRH (100µg) no dia nove. No experimento I, o monitoramento das estruturas ovarianas de 14 vacas foi realizado a cada 24h, desde o dia seis até 36h após a aplicação de GnRH em ambos os grupos. O tamanho médio do folículo dominante no dia nove foi de 11,1±0,99mm (BioRep n=7) e 11,5±0,65mm (IATF n=7) e todos os animais ovularam. No experimento II, no grupo BioRep (n=106), após a retirada do MAP, as fêmeas foram inseminadas com detecção de estro durante 48 horas. O restante dos animais do grupo BioRep e todos do grupo IATF (n=107) receberam 100µg de GnRH (dia nove) e IATF 16h depois. As taxas de prenhez foram de 57,6 por cento (BioRep) e de 52,3 por cento (IATF). O intervalo de 24h entre a retirada de MAP, mantido por oito dias, e a aplicação de GnRH não interfere na dinâmica folicular e na prenhez, permitindo inseminar vacas de corte amamentando sem observação de estro.